神经母细胞瘤（Neuroblastoma，NB）是起源于原始神经嵴细胞的恶性肿瘤，发生于交感神经系统。多见于婴幼儿，是儿童最常见的颅外实体肿瘤，占1岁以下婴儿肿瘤的50%，但NB引起的死亡率约占儿童肿瘤死亡率的15%。神经母细胞瘤容易发生远处转移，约三分之二的患者确诊时已是晚期，神经母细胞瘤常见的转移部位包括淋巴结、骨髓、骨、肝脏、皮肤等。目前神经母细胞瘤的治疗是根据危险分层选择不同的治疗方法。高危组患者虽然经过手术、化疗、放疗、自体干细胞移植及免疫治疗等综合治疗，仍有40%左右的高危患者死于疾病的转移和进展，是儿童实体肿瘤中亟待开发新的诊疗技术的重要疾病。

 
       液体活检（Liquid Biopsy）技术已经成为当前肿瘤研究领域的热点之一。与经典的组织活检技术相比，液体活检技术具有以下优点：1.无创性，仅凭少量外周血标本即可完成检测，不会引起肿瘤播散；2.实时性，可动态反应肿瘤细胞的遗传改变和演变进程，避免反复有创的组织活检；3.全面性，反映的是体内肿瘤细胞的分子遗传信息的全貌，避免了瘤内异质性对组织活检结果的影响；4.准确性，其所携带的分子遗传学信息来自原发肿瘤，具有高度敏感性和特异性。

       液体活检在表观遗传学水平对肿瘤的负荷、复发和转移进行评估是生物医学研究的潜力领域。神经母细胞瘤容易发生远处转移，晚期高危患者预后不佳，血浆细胞游离DNA (cfDNA)的表观测序有可能作为神经母细胞瘤的早期诊断、疗效预判、复发监测和预后判定的新的标志物。这种应用于实体肿瘤的检测方法原创于芝加哥大学，通过Nano-5hmC-Seal技术来实现。

                                              图1. 从外周血浆中提取细胞游离DNA并捕获5hmc

       MYC-N扩增作为神经母细胞瘤的生物标记物，其扩增比例占NB患者的20-30%，与高疾病风险和不良预后密切相关。荧光原位杂交（FISH）是目前临床实践中常用的检测MYCN拷贝数变化的方法。然而，这种方法需要患者提供组织标本，一般都是手术或者活检的标本，这对于无法手术或者提供的活检组织较少的患者来说是困难的，有时会导致重复活检，无疑对晚期患儿来说是耗时和痛苦的。

 
       中山大学肿瘤防治中心儿童肿瘤科张翼鷟教授在2022年SIOP Asia会议上汇报了近期团队的一项研究成果，创新性地通过5hmc结合PCR(5hmC-ddPCR)的方法，检测NB患者cfDNA中单个羟甲基化位点，准确判断MYCN在NB患者中的扩增状态。5hmC-ddPCR是非侵入性的，具有非常高的敏感性和特异性，5hmC-ddPCR方法可以作为一种准确且无创的方法来鉴别具有MYCN扩增的NB患者。尽管FISH目前是临床判断MYC-N扩增金标准，但也有其局限性；目前团队仍在致力于该技术的优化，希望未来能够助力为神经母细胞瘤诊断和预后判断。

                                                         图2. ddPCR反应流程

       对于神经母细胞瘤患者，如何实时地监测药物疗效和早期判断药物耐药是一个亟待解决的课题。通过外周血液体活检的形式来监测临床疗效，调整治疗方案，对患者进行最大受益的治疗，是提高生存的有效手段。